Hlavní obsah
Kurz: Fyzikální chemie > Kapitola 3
Lekce 1: Chromatografie a destilacePrincipy chromatografie
„Chromatografií“ se rozumí analytická technika běžně používaná pro oddělení směsi chemických látek na jednotlivé složky, které pak mohou být dále analyzovány. Existuje mnoho typů chromatografie, např. kapalinová chromatografie, plynová chromatografie, ionexová chromatografie, či afinitní chromatografie, ale všechny používají stejné základní principy.
Chromatografie je separační technika, kterou zná každý biochemik či organický chemik. Já sám jsem jako organický chemik běžně v laboratoři prováděl chromatografické separace různých směsí. Když jsem procházel své poznámky z výzkumu, objevil jsem obrázek chromatografické techniky, kterou jsem používal. Myslím, že obrázek by byl dobrým výchozím bodem pro tento článek!
Nejprve popíšu, co jsem vlastně prováděl. Měl jsem dvě výchozí látky „A“ a „B“. Ty jsem za určitých podmínek nechal reagovat, aby vznikl produkt „C“. Po ukončení reakce moje výsledná směs obsahovala zbytek nezreagované látky A, zbytek nezreagované látky B a výsledný produkt C. Nyní bylo mým úkolem oddělit tyto látky A, B a C tak, abych získal čistou látku C, kterou jsem pak mohl dále zkoumat.
Jak ukazuje obrázek nalevo, nejprve jsem provedl chromatografii na tenké vrstvě (TLC). Jedná se v podstatě o obdélníkovou skleněnou destičku potaženou vrstvou oxidu křemičitého. Na jeden konec jsem nanesl kapku reakční směsi (jak ukazuje tlustá čára), a celou destičku jsem umístil do nádoby s vhodně zvoleným organickým rozpouštědlem (v tomto případě směs hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1), tak, aby byl spodní okraj destičky v tomto rozpouštědle ponořen. Díky kapilárním silám začalo rozpouštědlo postupně vzlínat směrem nahoru a moji reakční směs tak rozdělilo na tři různobarevné skvrny ve chvíli, kdy rozpouštědlo dosáhlo horního okraje (čela) destičky.
Pro vlastní oddělení látek jsem sestavil sloupcovou kolonu (viz obrázek napravo). Skleněný válec jsem ve spodní části vybavil ventilem, přidal bavlněnou zátku a naplnil jsem jej silikagelem v organickém rozpouštědle. Jakmile byl válec naplněn, a výška rozpouštědla nad vrstvou silikagelu byla menší než 5 mm, převedl jsem pomocí skleněné pipety moji směs do horní části válce, aby tato směs protékala vrstvou silikagelu. Otevřel jsem ventil a nechal rozpouštědlo volně vytékat z válce, a rozpouštědlo jsem stále do válce vrchní částí doléval. Jak lze vidět na obrázku, reakční směs se začala dělit na tři oddělené barevné pruhy - žlutý, růžový a oranžový, odpovídající nezreagovaným zbytkům látek B, A a výsledného produktu C, v tomto pořadí. Jednotlivé barevné pruhy jsem jímal do různých baněk, abych získal svůj kýžený čistý produkt C!
Principy chromatografie
Pojďme se nejprve seznámit s určitými pojmy, které se v chromatografii běžně používají:
| Pojem | Definice |
|---|---|
| Mobilní fáze nebo nosič | rozpouštědlo pohybující se kolonou |
| Stacionární fáze nebo adsorbent | látka, která zůstává vázána uvnitř kolony |
| Eluent | tekutina vstupující do sloupce |
| Eluát | tekutina opouštějící kolonu (jímaná v baňkách) |
| Eluce | proces vymývání směsi pomocí vhodného rozpouštědla |
| Analyt | směs, jejíž jednotlivé složky je třeba oddělit a analyzovat |
Pojďme si princip chromatografie ukázat na obrázku znázorňující dělení látek pomocí sloupcové chromatografie.
Jak zobrazuje obrázek, analyt je přiveden na silikagelovou náplň kolony, která zde slouží jako stacionární fáze. Rozpouštědlo (mobilní fáze) začne protékat náplní ze silikagelu (za pomoci působení gravitace či tlaku). Různé složky analytu mají rozdílnou míru adheze k silikagelu (viz níže), a tudíž prostupují kolonou, za pomoci rozpouštědla, různě rychle, což vede ke vzniku různobarevných pruhů. Složky směsi, které jsou pevněji vázány na stacionární fázi se pohybují kolonou pomaleji než ty složky, které jsou vázány slaběji. Analytická chromatografie se používá k přečištění látek v řádech miligramů až gramů.
Než budeme pokračovat, můžeme provést jednoduchý experiment, který ukáže sílu chromatografické separace.
- Rozmělníme několik listů v hmoždíři.
- Na pruh chromatografického papíru se kápne kapka extraktu z nadrcených listů cca 0,5 cm nad okraj papíru. Chromatografický papír je vyroben z celulózy a je polární.
- Do nádoby (cely) umístíme pruh papíru, která obsahuje malé množství propanonu (acetonu). Množství acetonu stačí takové, aby se do něj ponořil okraj papíru. Tuto nádobu uzavřeme, aby se zabránilo odpařování rozpouštědla.
- Rozpouštědlo díky kapilární elevaci začne vzlínat. Papírek vyjmeme z kolony, jakmile rozpouštědlo dosáhne úrovně „čela rozpouštědla“. 5) Co si myslíš, že se stane?
Různé složky barviv listů se rozdělily! Napadlo tě někdy, že barva listu je složena z tolika složek?
Princip rozdělení různých složek: Rozdílná afinita (síla adheze) jednotlivých složek analytu vůči stacionární a mobilní fázi, která ovlivní rozdělení těchto složek. Afinita je ovlivněna dvěma vlastnostmi molekul: „adsorpce“ a „rozpustnost.“
Adsorpci lze definovat jako vlastnost složky, popisující jak silně se složka udrží na stacionární fázi, zatímco rozpustnost popisuje, jak dobře se složka rozpustí v mobilní fázi.
- Čím větší je adsorpce na stacionární fázi, tím pomaleji molekula projde kolonou.
- Čím větší je rozpustnost v mobilní fázi, tím rychleji molekula projde kolonou.
Vzájemný poměr mezi těmito faktory určuje rozdílné rychlosti, s jakými se jednotlivé složky analytu pohybují kolonou. Adsorpci a rozpustnost molekuly lze ovlivnit vhodným výběrem stacionární a mobilní fáze.
Nabízí se otázka, proč mají různé sloučeniny odlišnou afinitu ke stacionární a mobilní fázi. „Polarita“ sloučenin určuje jejich afinitu vůči stacionární a mobilní fázi. Pojďme si to vysvětlit na příkladu.
Předpokládejme, že máme směs dvou molekul A a B, kde „A“ je bílkovina a „B“ je lipid. Kolona je naplněna silikagelem, který je polární; mobilní fází je hexan, který je nepolární. Co si myslíte, že se stane, když převedeme naši směs molekul A a B do této kolony?
Protože molekula „A“ je polární, adsorbuje se na polární stacionární fázi (silikagel). Molekula „B“ je nepolární, bude tak v nepolární mobilní fázi (hexan) snadno rozpuštěna, aniž by se adsorbovala na silikagel, a snadno se tak vymyje hexanem z kolony. Jakmile je molekula B vymyta z kolony, mobilní fáze se vymění na něco polárního, jako je acetonitril. Molekula A tak bude nucena oddělit se od silikagelu, rozpustit se v polárním rozpouštědle a eluovat se z kolony společně s acetonitrilem. Tento proces je znázorněn na následujícím obrázku.
Různé druhy chromatografie
V celém tomto článku se zabýváme tím, co označujeme jako normální chromatografii, tedy že naše stacionární fáze je polární (hydrofilní), a že mobilní fáze je nepolární (hydrofobní). U speciálních aplikací však vědci někdy používají chromatografickou techniku reverzní fáze, tedy kdy stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze je polární.
Existuje několik druhů chromatografie, z nichž každý se liší v typu stacionární a mobilní fáze, kterou používá. Základní princip zůstává však stejný: různé afinity jednotlivých složek analytu ke stacionárním a mobilním fázím vede k rozdílné separaci složek. Režim interakce různých složek se stacionární a mobilní fází se může opět změnit v závislosti na použité chromatografické technice. Obecně používané chromatografické techniky jsou uvedeny v následující tabulce.
| Technika | Stacionární fáze | Mobilní fáze | Princip separace | Poznámky |
|---|---|---|---|---|
| *Papírová chromatografie | pevná (celulóza) | kapalná | polarita molekul | směs nanášena přímo na celulózový papír |
| *Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) | pevná (silikagel nebo oxid hlinitý) | kapalná | polarita molekul | sklo je pokryto tenkou vrstvou silikagelu, na kterou je nanášena směs |
| *Kapalinová sloupcová chromatografie | pevná (silikagel nebo oxid hlinitý) | kapalná | polarita molekul | skleněná kolona vyplněná silikagelem v kapalině |
| Rozměrově-vylučovací chromatografie | pevná (mikroporézní kuličky silikagelu) | kapalná | velikost molekul | malé molekuly jsou zachycovány v mikropórech stacionární fáze, zatímco větší molekuly proudí mezerami mezi kuličkami a mají velmi malý retenční čas. Větší molekuly tedy projdou kolonou dříve. Tento druh chromatografie nevyužívá žádný typ vzájemného působení, jak fyzikálního tak chemického, mezi analytem a stacionární fází. |
| Ionexová chromatografie | pevná (kationtová či aniontová pryskyřice) | kapalná | iontový náboj molekul | molekuly s opačným náboj, než jaký má pryskyřice, se na ni pevně naváží, zatímco molekuly se stejným nábojem jako pryskyřice volně projdou kolonou a z kolony odchází jako první. |
| Afinitní chromatografie | pevná (agaróza nebo porézní skleněné kuličky s navázanými molekulami enzymů či protilátek) | kapalná | vazebná afinita molekul analytu k molekulám navázaným na stacionární fázi | pokud je molekula substrátem pro navázaný enzym, pevně se k němu naváže, nenavázané molekuly analytu budou protékat spolu s mobilní fází ven z kolony, zanechávající substrát navázaný na enzymu. Substrát je pak vymýván jiným vhodným rozpouštědlem. |
| Plynová chromatografie | kapalná nebo pevná | plynná (inertní plyn, např. argon nebo helium) | teplota varu molekul | vzorky jsou vypařeny a molekuly s nejnižší teplotou varu odchází z kolony jako první. Molekuly s nejvyšší teplotou varu odcházejí z kolony jako poslední. |
*Patří do kategorie „Kapalná chromatografie“
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC): Retenční faktory (R
Připomeňme si, že chromatografie na tenké vrstvě probíhá na kusu skleněné destičky, která je pokryta tenkou vrstvou silikagelu. Tato vrstva silikagelu funguje jako stacionární fáze a rozpouštědlo, ve kterém je tato destička namočena, a které vzlíná po destičce směrem vzhůru, je mobilní fáze. Stacionární fáze, v tomhle případě silikagel, je velmi polární, zatímco rozpouštědlo je ve srovnání se silikagelem méně polární.
Polární složky analytu se budou vázat na silikagel, a proto budou velmi pomalu putovat vzhůru po destičce, zatímco méně polární či nepolární složky analytu se nebudou tak silně vázat na silikagel, a po destičce se budou posunovat spolu s rozpouštědlem. Vraťme se teď k prvnímu obrázku tohoto článku.
Jak je znázorněno výše, tři složky A, B a C reakční směsi urazily různé vzdálenosti, spolu s rozpouštědlem, které postupovalo směrem vzhůru po destičce. Měřeno od počátku (kam jsme umístili reakční směs): složka C urazila 1 cm, složka A urazila 2 cm a složka B urazila 3 cm. Rozpouštědlo urazilo celkem 5 cm (vzdálenost od počátku k čelu rozpouštědla).
Základní pravidla:
- Složka, která urazí nejmenší vzdálenost na TLC destičce je nejvíce polární, jelikož se nejpevněji váže na silikagel.
- Složka, která urazí největší vzdálenost je nejméně polární; na silikagel se váže slabě, a je nejvíce rozpustná v nepolárním rozpouštědle (mobilní fázi), a postupuje tedy po destičce spolu s rozpouštědlem.
Z pohledu na TLC destičku tak lze snadno říct, která složka je polární, a která je méně polární. Existuje také kvantitativní parametr, nazývaný retenční faktor (R
Retenční faktor je definován jako vzdálenost, kterou daná složka urazila, dělená celkovou vzdáleností, kterou urazilo rozpouštědlo. „Čím nižší hodnota R
| Složka | Vzdálenost, kterou složka urazila(cm) | Vzdálenost, kterou urazilo rozpouštědlo (cm) | Retenční faktor (R |
|---|---|---|---|
| C | 1 | 5 | R |
| A | 2 | 5 | R |
| B | 3 | 5 | R |
Na základě hodnot R
Chceš se zapojit do diskuze?
Zatím žádné příspěvky.