Hlavní obsah

Kinetika reakcí katalyzovaných enzymy – základy, grafy

Jak rozumět grafům enzymových reakcí, jak takové grafy vznikají. Představíme si veličiny Km a Vmax a také kompetitivní a nekompetitivní inhibici.

Úvod

Představ si, že jsi v obchodě s luxusními sportovními auty. Abys vybral to nejlepší, budou tě asi zajímat, jaké možnosti nabízí (Ferrari, Porsche, Jaguar, atd.). Jednou ze zřejmých věcí je jeho maximální rychlost. Taky tě ale asi bude zajímat jeho výkon, tedy jak rychle se dokáže dostat z klidu na rychlost 100 km/h. Nezajímá nás tedy pouze maximální rychlost, ale i kinetika toho, jak rychle je této rychlosti auto schopno dosáhnout.

Pro biochemiky jsou podobné myšlenky týkající se enzymů denním chlebem. Chtějí vědět co nejvíce informací o enzymu, hlavně jak ovlivňuje reakční rychlost, nejen to, jak rychle se dokáže pohybovat.

O tom, jak enzym funguje, a jak interaguje s jinými molekulami (jako jsou inhibitory) můžeme zjistit překvapivé množství informací pouhým měřením toho, jak rychle katalyzuje reakci v různých podmínkách. Informace z těchto experimentů jsou často znázorněny pomocí grafů, takže se chvilku budeme zabývat tím, jak tyto grafy vznikají (a jak je se čtou, aby pro nás byly co nejužitečnější).

Základní grafy enzymatické kinetiky

Abychom mohli obrazově vyjádřit informace o enzymatické kinetice, často používáme grafy podobné tomu níže (graf závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu). Poskytují mnoho užitečných informací, ale na první pohled můžou být trochu matoucí. Tady ti ukážeme, jak takový graf vytvořit a číst.

Představ si, že máš ve zkumavce nějaký enzym a chceš se dozvědět více o jeho chování za různých podmínek. Provedeš proto sérii pokusů, při nichž vezmeš různé koncentrace substrátu –⁠ řekněme 0 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M a 1,0 M –⁠ a zjistíš rychlost reakce (tj. jak rychle se substrát změní na produkt), když do každého substrátu přidáš enzym. Samozřejmě musíš dávat pozor, abys do každé reakce přidal(a) stejnou koncentraci enzymu –⁠ abys „porovnával(a) jablka s jablky“.

Jak určíš rychlost reakce? Zajímá nás počáteční rychlost reakce při propojení enzymu se substrátem a jestli enzym katalyzuje reakci tak rychle, jak je to při dané koncentraci substrátu možné (protože rychlost reakce se nakonec zpomalí na nulu, jakmile se substrát spotřebuje). Množství produktu vytvořeného za určitou jednotku času bys tedy měřil(a) hned na začátku reakce, kdy koncentrace produktu lineárně roste. Tato hodnota, množství produktu vzniklého za určitou jednotku času na začátku reakce, se nazývá počáteční rychlost neboli

V_{0}

dané koncentrace.

Řekněme, že jsi zjistil(a) hodnotu všech koncentrací, které tě zajímají. Pak můžeš do grafu vynést každou koncentraci substrátu a její hodnotu

V_{0}

jako uspořádanou dvojici [X; Y]. Jakmile do grafu vyneseš všechny dvojice [X; Y] různých koncentrací, můžeš body spojit křivkou, vznikne ti tak graf. U mnoha typů enzymů bude vzniklý graf připomínat fialovou linku znázorněnou výše: hodnoty

V_{0}

budou rychle narůstat při nízkých koncentracích substrátu a při vysokých koncentracích substrátu se rovnoměrně rozloží na ustálenou úroveň.

K této ustálené úrovni dochází proto, že enzym je nasycený, což znamená, že všechny dostupné molekuly enzymu jsou již vázány na zpracovávání substrátů. Jakékoli další molekuly substrátu budou muset počkat, až bude k dispozici jiný enzym, takže rychlost reakce (množství produktu vzniklého za určitou jednotku času) je omezena koncentrací enzymu. Tato maximální rychlost reakce je charakteristická pro konkrétní enzym při konkrétní koncentraci a říká se jí maximální rychlost neboli $V_{m a x}$ ‍.

V_{m a x}

je hodnota Y (počáteční hodnota rychlosti reakce), při které výše uvedený graf dosáhne vrcholu.

Koncentrace substrátu, při které je rychlost reakce na polovině hodnoty

V_{m a x}

, se označuje $K_{m}$ ‍. Je to užitečné měřítko toho, jakou rychlostí se zvyšuje rychlost reakce s koncentrací substrátu.

K_{m}

je také měřítkem afinity enzymu k substrátu (tedy tendence vázat se na něj). Nižší hodnota

K_{m}

odpovídá vyšší afinitě k substrátu, zatímco vyšší hodnota

K_{m}

odpovídá nižší afinitě k substrátu. Na rozdíl od hodnoty

V_{m a x}

, která závisí na koncentraci enzymu, je

K_{m}

pro konkrétní enzym, který charakterizuje danou reakci, vždy stejné (i když „zdánlivá“ nebo experimentálně změřená hodnota

K_{m}

může být změněna inhibitory, jak je uvedeno níže).

Grafy a inhibitory enzymatické kinetiky

A co inhibitory? Ve článku o regulaci enzymů jsme mluvili o dvou typech inhibitorů, kompetitivních a nekompetitivních.

Kompetitivní inhibitory zhoršují průběh reakce tím, že se vážou na enzym, často na aktivním místě, a brání vazbě skutečného substrátu. V daném okamžiku může být na enzym navázán pouze kompetitivní inhibitor nebo substrát (ne obojí). To znamená, že inhibitor a substrát soutěží o enzym. Kompetitivní inhibice působí tak, že snižuje počet molekul enzymu, které jsou k dispozici pro vazbu substrátu.
Nekompetitivní inhibitory nebrání vazbě substrátu na enzym. Inhibitor a substrát navzájem vůbec neovlivňují vazbu na enzym. Pokud je však inhibitor vázaný, enzym nemůže katalyzovat svou reakci a vytvořit produkt. Nekompetitivní inhibice tedy působí tak, že snižuje počet funkčních molekul enzymu, které mohou provádět reakci.

Pokud bychom chtěli účinky těchto inhibitorů znázornit na grafu podobném výše uvedenému, mohli bychom celý experiment zopakovat ještě dvakrát: jednou s určitým množstvím kompetitivního inhibitoru přidaným do každé testovací reakce a jednou s určitým množstvím nekompetitivního inhibitoru přidaným místo něj. Získali bychom následující výsledky:

S kompetitivním inhibitorem může reakce nakonec dosáhnout normální hodnoty $V_{m a x}$ ‍, ale je k tomu zapotřebí vyšší koncentrace substrátu. Jinak řečeno, $V_{m a x}$ ‍ se nemění, ale zdánlivá hodnota $K_{m}$ ‍ je vyšší. Proč musí být přidáno více substrátu, aby bylo dosaženo $V_{m a x}$ ‍? Díky dodatečnému substrátu je molekul substrátu dost na to, aby důsledně „přebíjely“ molekuly inhibitoru k enzymu.
S nekompetitivním inhibitorem nemůže reakce nikdy dosáhnout normální hodnoty $V_{m a x}$ ‍ bez ohledu na to, kolik substrátu přidáme. Určitá podskupina molekul enzymu bude vždy „otrávena“ inhibitorem, takže efektivní koncentrace enzymu (která určuje hodnotu $V_{m a x}$ ‍) je snížena. Při stejné koncentraci substrátu však reakce dosáhne poloviny své nové hodnoty $V_{m a x}$ ‍, takže hodnota $K_{m}$ ‍ se nezmění. Nezměněná hodnota $K_{m}$ ‍ odráží skutečnost, že inhibitor nemá vliv na vazbu enzymu na substrát, pouze snižuje koncentraci použitelného enzymu.

Nekompetitivní a kompetitivní inhibitory jsou kategorie inhibitorů, které mají jasně dané kinetické chování. Existují však i další typy inhibitorů, které mají různé typy účinků na

V_{m a x}

K_{m}

Různé typy inhibitorů se rozlišují podle toho, zda se vážou pouze na volný enzym, pouze na komplex enzym-substrát nebo na enzym i na komplex enzym-substrát (a také podle jejich relativní afinity k těmto dvěma formám). Další informace o inhibitorech a teorii jejich chování najdeš v části enzymatická kinetika podle Michaelise a Mentenové.

Stručné shrnutí některých hlavní kategorie inhibitorů:

Kompetitivní inhibitor, jak je uvedeno výše, se váže pouze na volný enzym (a nemůže se vázat na komplex enzym-substrát). Kompetitivní inhibice neovlivňuje hodnotu $V_{m a x}$ ‍, ale zvyšuje zdánlivou hodnotu $K_{m}$ ‍.
Akompetitivní inhibitor (není totéž co nekompetitivní inhibitor!) se váže pouze na komplex enzym-substrát, nikoli na volný enzym. Akompetitivní inhibitor snižuje hodnotu $V_{m a x}$ ‍ a také snižuje zdánlivou hodnotu $K_{m}$ ‍.
Smíšený inhibitor vykazuje chování mezi kompetitivním a akompetitivním inhibitorem. Váže se jak na volný enzym, tak na komplex enzym-substrát, ale má vyšší afinitu (tendenci vázat se) k jedné formě než k druhé. Smíšené inhibitory důsledně snižují hodnotu $V_{m a x}$ ‍, ale mohou buď zvyšovat, nebo snižovat zdánlivou hodnotu $K_{m}$ ‍ v závislosti na tom, na kterou formu enzymu (volnou nebo vázanou na substrát) se vážou silněji $^{1}$ ‍.
Nekompetitivní inhibitor, jak bylo uvedeno výše, se váže jak na volný enzym, tak na komplex enzym-substrát, a nenarušuje rovnováhu mezi nimi. (Jinými slovy, má stejnou afinitu jak k enzymu, tak ke komplexu enzym-substrát.) Nekompetitivní inhibice je vlastně jen zvláštním případem smíšené inhibice, kdy se inhibitor váže na enzym i na komplex enzym-substrát se stejnou afinitou. Čistá nekompetitivní inhibice snižuje hodnotu $V_{m a x}$ ‍, ale nemění hodnotu $K_{m}$ ‍ $^{1}$ ‍.

Rovnice Michaelise-Mentenové a alosterické enzymy

Mnoho enzymů se chová podobně jako hypotetický enzym ve výše uvedeném příkladu a vytváří parabolické křivky, když se rychlost reakce do grafu zakreslí jako funkce koncentrace substrátu. Enzymy, které se takto chovají, lze často popsat rovnicí vztahující se ke koncentraci substrátu, počáteční rychlosti,

K_{m}

V_{m a x}

, které se říká rovnice Michaelise-Mentenové. Pokud se chceš podrobněji seznámit s rovnicí Michaelise-Mentenové a modelem, který je jejím základem, můžeš se podívat na videa o rovnici Michaelise-Mentenové.

Enzymy Michaelise-Mentenové se liší od alosterických enzymů (o nichž pojednává hlavní článek o regulaci enzymů). Alosterické enzymy mají obvykle více aktivních míst a často vykazují kooperativitu, což znamená, že vazba substrátu na jedno aktivní místo zvyšuje schopnost ostatních aktivních míst vázat se a zpracovávat substráty.

Kooperativní enzymy reagují na změny koncentrace substrátu citlivěji než jiné enzymy. Při zvyšování koncentrace substrátu se projevuje přechod od nízké k vysoké reakční rychlosti. To odpovídá křivce závislosti rychlosti na koncentraci substrátu, která má tvar písmene S, jak je znázorněno výše.

Zdroje:

Tento článek byl připraven na základě textu „Enzymes“ od OpenStax College, Biology, CC BY 3.0. Původní článek si můžeš zdarma stáhnout zde (v angličtině): http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@9.85.

Upravený článek je licencovaný pod CC BY-NC-SA 4.0.

Citace a literatura

Brandt, M. (2010). Inhibition kinetics. V CHEM 330 biochemistry website, 81. Získáno z https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.

Zdroje:

Berg, J. M., Tymoczko, J. L. a Stryer, L. (2002). Michaelis-Menten model accounts for the kinetic properties of many enzymes. V Biochemistry (5. vyd., část 8.4). New York, NY: W. H. Freeman. Získáno z http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22430/.

Berg, J. M., Tymoczko, J. L. a Stryer, L. (2007). Enzymes can be inhibited by specific molecules. V Biochemistry (6. vyd., části 225-234). New York, NY: W. H. Freeman.

Brandt, M. (2010). Inhibition kinetics. V CHEM 330 biochemistry website, 80-83 Získáno z https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.

Gutierrez, R. (2011). Bio41 Week 5 — Biochemistry Lectures 4-6. Biosci 41, Stanford.

Mixed inhibition. (4. prosince 2015). Získáno 15. února 2016 z Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Mixed_inhibition.

Non-competitive inhibition. (2. prosince 2015). Získáno 15. února 2016 z Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-competitive_inhibition.

Chceš se zapojit do diskuze?

Přihlášení

Setřídit podle:

Zatím žádné příspěvky.

Umíš anglicky? Kliknutím zobrazíš diskuzi anglické verze Khan Academy.

Fyzikální chemie

Kurz: Fyzikální chemie > Kapitola 4

Úvod

Základní grafy enzymatické kinetiky

Grafy a inhibitory enzymatické kinetiky

Rovnice Michaelise-Mentenové a alosterické enzymy

Chceš se zapojit do diskuze?