Hlavní obsah
Biologie
Kurz: Biologie > Kapitola 1
Lekce 1: Úvod k buňkámMikroskopie
Úvod do mikroskopů a způsob jejich fungování. Zahrnuje světelnou mikroskopii, fluorescenční mikroskopii a elektronovou mikroskopii.
Úvod
Jestliže potkáte buněčného biologa a pustíte se s ním do rozhovoru o tom, co mají na své práci rádi nejvíce, může to skončit u jedné věci: v hloubi duše to jsou nadšenci do mikroskopů. Ke konci dne totiž rádi uvítají možnost sedět hodiny v temné malé místnosti sledujíc jejich oblíbený typ buněk skrze čočky jejich krásného mikroskopu. Může to znít zvláštně, ale pravdou je, že buňky mohou vypadat opravdu nádherně, jako barevné sklo. Jeden z mých oblíbených příkladů je na obrázku níže, ve kterém je buňka mladého listu malé kvetoucí rostliny příbuzné hořčici seté - Husečníku rolního.
Tento obrázek není pouhým světlým mikrosnímkem; je to fluorescenční obraz speciálně připraveného vzorku, ve kterém byly jednotlivé části buněk označeny speciálním barvivem, aby mohly svítit. Nicméně takový typ buněčné komplexnosti a krásy je všude kolem nás, ať už jsme schopni ji vidět či ne.
Buňky se někomu mohou jevit jako komplikované útvary, jiným naopak jako zajímavé tvary přítomné v každé rostlině. Ať už to jsou růže u na dvorku, tráva rostoucí skrze dlažbu chodníku nebo mrkve, které jsi měl ke svačině. Nemusíme se ale omezovat pouze na rostliny. Překrásné vrstvy buněk najdeme i v naší kůži (epidermis), v křídlech hmyzu anebo v kterékoliv tkáni živého organismu. My a také svět kolem nás jsou stavěny jako katedrály vystavěné z buněk. Abychom to však ocenili, potřebujeme k tomu mikroskopii.
Mikroskop a jeho čočky
Ačkoliv buňky se od sebe velikostně odlišují, jsou obecně velmi malé. Například průměr lidské červené krvinky je asi 8 mikrometrů (0,0008 milimetrů). Abyste si to lépe představili, hlavička špendlíku má průměr 1 milimetr, což je zhruba 125 červených krvinek seřazených vedle sebe. Mimo pár výjimek nejsou buňky pro lidské oko viditelné, a proto musí vědci pro svůj výzkum použít mikroskopii (odvozeno ze slov mikro = „malý“; skopie = „druhá část složených slov mající význam zjišťující“). Mikroskop je optický přístroj, který využívá k zobrazení velmi malých objektů viditelné světlo. Mnoho snímků buněk pochází právě z mikroskopu. Těmto snímkům se také říká mikrosnímek.
Může se zdát, že mikroskop dle popisu výše je pouze nějaké zvětšovací sklo. Faktem je, že typ obsažené optiky vymezuje druh mikroskopu. Jednoduchý mikroskop se skládá pouze z jedné soustavy spojných čoček. Čím složitější optická soustava, tím spíš se může jednat o pokročilý mikroskop. Stavba těchto čoček dokáže lámat světlo mnohem lépe a tím zvětšit pozorovaný objekt než jednoduchá lupa.
V pokročilém mikroskopu má uspořádání čoček zajímavý důsledek: orientace obrazu je převrácená vůči reálnému obrazu, který pozorujeme. Například pokud pozoruji kus výtisku z písmenek „e“, obraz v mikroskopu by se jevil jako “ə". Některé pokročilejší mikroskopické systémy nemusí podávat převrácený obraz díky přídavné čočce, která ho změní v přímý obraz.
Co odlišuje základní mikroskop od pokročilého přístroje využitého ve vědecké laboratoři? V mikroskopii jsou pro to důležité dva parametry: zvětšení a rozlišení.
- Zvětšení udává, o kolik mikroskop (nebo soustava čoček v mikroskopu) zvětší objekt, který pozorujeme. Například světelný mikroskop typicky využívaný na středních školách zvětšuje až 400x. Například objekt široký 1 mm v reálném měřítku by měl 400 mm v mikroskopickém obraze.
- Rozlišení mikroskopu nebo čočky je dáno nejmenší vzdáleností dvou bodů, které od sebe ještě rozlišíme. Čím menší hodnota, tím vyšší je rozlišovací schopnost mikroskopu a tím i detailnost obrazu. Pokud bychom na sklíčku pozorovali dvě bakteriální buňky blízko sebe, mohly by se na mikroskopu s nižší rozlišovací schopností jevit jako jedna rozmazaná tečka. Naopak s vyšší rozlišovací schopností jsme schopni je detailnější pozorovat a odlišit je od sebe.
Zvětšení a rozlišení jsou důležité hodnoty pro detailní pozorování velmi malých preparátů. Vysoké zvětšení a malá rozlišovací schopnost by měla za následek pouze zvětšený rozmazaný objekt. Rozlišujeme různé typy mikroskopů s různými hodnotami zvětšení a rozlišení.
Světelný mikroskop
Převážná většina studentských mikroskopů jsou klasifikována jako světelné mikroskopy. Ve světelném mikroskopu prochází viditelné světlo skrze preparát (biologický vzorek, který pozorujeme) a láme se skrze optickou soustavu, umožňující pozorovateli vidět zvětšený obraz. Výhoda světelného mikroskopu spočívá v možnosti pozorovat živé buňky a jejich procesy a fungování (migrace nebo dělení).
Školní mikroskopy umožňují tedy pozorovat v takzvaném. světlém poli, také jinak pro pozorování v procházejícím světle. Světlo procházející skrze preparát tvoří v okulárech skutečný zvětšený obraz. Sofistikovanější formy světelné mikroskopie, takzvané. kontrastní metody, slouží ke zvýšení kontrastu obrazu tak, aby byl dobře pozorovatelný (například průhledné buňky).
Další pozorovací metodou může být fluorescenční mikroskopie, která zobrazuje vzorky se schopností fluoreskovat. Fluorescence je děj, při němž záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce. Ve většině případů nemají pozorované buňky či tkáně vlastnost fluorescence, a proto je nutné je cíleně označit speciálním fluorescenčním barvivem.
Obrázek listu na začátku článku byl nasnímán speciální fluorescenční metodou – konfokální mikroskopie. Mikroskopický obraz konfokálního mikroskopu vytváří počítač na základě intenzity fluorescence měřené bod po bodu, které postupně ozařuje laserový paprsek. Výsledkem je velmi ostrý obraz bez jakékoliv interference molekul v okolí bodu.
Elektronová mikroskopie
Na hranici možností ve světelné mikroskopii (mnohem dále než metody výše zmiňované) můžeme získat velmi vysoké rozlišení. Nicméně pokud bychom chtěli pozorovat opravdu něco velmi malého ve vysokém rozlišení, musíme šáhnout po jiné vyzkoušené technologii a tou je elektronová mikroskopie.
Elektronové mikroskopy se od světelných mikroskopů odlišují principem ozáření vzorku využitím elektronového paprsku emitovaného z rozžhaveného wolframového vlákna. Tyto paprsky mají mnohem kratší vlnovou délku než viditelné světlo. To umožňuje elektronovým mikroskopům vytvářet snímky s mnohem vyšším rozlišením než u klasických světelných mikroskopů. Elektronové mikroskopy mohou být využity nejenom k pozorování celých buněk, ale také buněčných struktur a jejich kompartmentů.
Jedinou limitací je typ preparátu, který musí být umístěn ve vakuu a předchází fixačnímu procesu, který je třeba zahájit v co nejkratší době po odběru (Jinak hrozí poškození hypoxií). Z toho vyplývá, že můžeme pozorovat pouze fixní preparáty namísto živých buněk.
Na obrázku výše můžeme porovnat, jak vypadá bakterie Salmonella v procházejícím světle (vlevo) a na obrázku z elektronového mikroskopu (vpravo). Ve světlém poli nalevo se bakterie jeví jako fialové útvary. Pod elektronovým mikroskopem můžeme naopak jasně pozorovat jejich tvar a texturu a zároveň okolní detaily v podobě lidských buněk, které se snaží bakterii napadnout.
Rozlišujeme dva hlavní typy elektronových mikroskopů. Rastrovací (řádkovací) elektronový mikroskop (SEM), jehož elektronový paprsek skenuje řádek po řádku napříč povrchem vzorku tkáně nebo buňky. Výsledkem je velmi detailní obraz 3D povrchu. Tento typ mikroskopu byl použit k pořízení snímku bakterie Salmonella vyobrazené výše v článku.
Druhým typem je transmisní (prozařovací) elektronový mikroskop (TEM). V tomto případě je vzorek před pozorováním připraven na velmi tenké řezy (např. využitím diamantové řezací čepele). Svazek elektronů prochází skrze řez namísto skenování povrchu. TEM se často využívá k detailnímu pozorování vnitřních struktur buněk například v diagnostické patologii.
Elektronové mikroskopy, jako je ten na obrázku výše, jsou značně objemnější a také mnohem dražší než standardní světelné mikroskopy. Není se překvapivě čemu divit, když si musí poradit se subatomárními částicemi!
Chceš se zapojit do diskuze?
Zatím žádné příspěvky.